【His-Tag（表达蛋白纯化原理、方法和问题分析）】在现代生物技术研究中，重组蛋白的表达与纯化是蛋白质功能研究、药物开发及诊断试剂制备的重要环节。其中，His-Tag（组氨酸标签）技术因其高效、简便、适用性广等优点，已成为蛋白质纯化领域中应用最为广泛的方法之一。本文将围绕 His-Tag 蛋白纯化的原理、常用方法以及常见问题进行系统分析。
一、His-Tag 蛋白纯化的基本原理
His-Tag 是一种由 6~10 个连续组氨酸残基组成的短肽序列，通常被融合在目标蛋白的 N 端或 C 端。由于组氨酸的咪唑环具有较强的金属离子配位能力，特别是在 pH 为 4.5~8.0 的条件下，His-Tag 可以与镍（Ni²⁺）、钴（Co²⁺）等二价金属离子形成稳定的配位键。
在纯化过程中，通常使用含有 Ni²⁺ 或 Co²⁺ 的亲和层析介质（如 Ni-NTA 或 Co-IMAC），通过金属离子与 His-Tag 的特异性结合，实现对目标蛋白的选择性捕获。随后，通过逐步降低洗脱液中的咪唑浓度或改变 pH 值，可将结合的目标蛋白从柱子上洗脱下来，从而完成纯化过程。
二、His-Tag 纯化的主要方法
1. 亲和层析法（Affinity Chromatography）
这是最常见的 His-Tag 蛋白纯化方式。利用 Ni²⁺ 或 Co²⁺ 固定在树脂上的亲和介质，对 His-Tag 融合蛋白进行选择性吸附。该方法操作简单、效率高，适用于大多数表达系统。
2. 洗涤与洗脱步骤
在吸附完成后，需用低浓度咪唑溶液进行初步洗涤，去除非特异性结合的杂质。随后，逐渐增加咪唑浓度或调整 pH，使 His-Tag 蛋白从柱子上解离并收集。
3. 优化条件
不同的表达系统和蛋白性质可能需要对洗脱条件（如咪唑浓度、pH 值、离子强度等）进行优化，以提高纯度和回收率。
三、His-Tag 纯化中常见的问题及解决策略
1. 蛋白不结合或结合率低
- 原因：His-Tag 序列过短、蛋白构象变化导致暴露不足、缓冲液条件不合适等。
- 解决：延长 His-Tag 长度（如 8~10 个组氨酸），优化缓冲液组成，确保蛋白处于正确折叠状态。
2. 非特异性结合
- 原因：杂蛋白与金属离子发生非特异性结合，或样品中含有干扰物质。
- 解决：增加洗涤步骤，使用更高质量的亲和介质，或在裂解液中加入去垢剂（如 Triton X-100）以减少非特异性吸附。
3. 洗脱后蛋白活性下降
- 原因：咪唑浓度过高或洗脱条件不当，导致蛋白结构破坏。
- 解决：控制咪唑浓度范围，避免过高的洗脱强度；必要时采用梯度洗脱法。
4. His-Tag 残留影响后续实验
- 原因：某些实验要求去除 His-Tag，如结构分析或免疫检测。
- 解决：可使用蛋白酶（如 TEV、Factor Xa）进行切割，或在表达载体中设计可切割的连接序列。
四、结语
His-Tag 技术作为蛋白质纯化的一种重要手段，凭借其高效、便捷的特点，在生命科学研究中占据着不可替代的地位。然而，实际操作中仍需根据具体实验目的和蛋白特性，灵活调整实验参数，以达到最佳的纯化效果。随着蛋白质工程和生物技术的不断发展，His-Tag 方法也在不断优化和完善，未来将在更多领域发挥更大作用。
