在实验操作中，首先将一种特异性抗体固定于固相载体表面，如酶标板孔壁上。这种抗体被称为捕获抗体，它能够与待测样品中的目标抗原特异性结合。随后加入含有未知浓度抗原的样本，让其与捕获抗体充分接触并形成稳定的复合物。
接着引入第二种抗体——检测抗体。该抗体同样针对同一抗原表位，但与捕获抗体具有不同的结合位点，因此不会相互干扰。检测抗体通常标记有可产生可检测信号的物质，例如酶、荧光染料或放射性同位素等。当检测抗体成功结合到已形成的抗原-捕获抗体复合物后，便形成了所谓的“夹心结构”。
为了进一步增强检测灵敏度，在某些情况下还会添加第三步——即使用与检测抗体相对应的第二抗体（也称为桥接抗体），其作用是连接更多的标记分子以增加信号强度。最终通过测量所产生的信号强度来定量分析样品中抗原含量。
双抗体夹心法因其高特异性、良好的重复性和较低的成本而备受青睐，并广泛应用于医学诊断、食品安全监测以及环境污染物筛查等多个领域。然而值得注意的是，在实际应用过程中需要严格控制实验条件，包括但不限于pH值、温度及孵育时间等因素，以确保获得准确可靠的结果。
